중온성 및 호열성 PET 가수분해효소 특성을 모두 갖춘 PET 가수분해효소의 발견 및 합리적인 엔지니어링

Nature Communications 14권, 기사 번호: 4556(2023) 이 기사 인용

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과도한 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET) 폐기물은 다양한 문제를 야기합니다. PET 바이오 재활용을 위한 우수한 PET 가수분해효소 개발에 초점을 맞춘 광범위한 연구가 수행되었습니다. 그러나 효소 공학에 사용되는 템플릿 효소는 주로 중온성 및 호열성 가수분해 특성을 나타내는 IsPETase 및 잎가지 퇴비 큐티나제에 중점을 두었습니다. 여기에서 우리는 주변 온도에서 높은 열 안정성과 놀라운 PET 분해 활성을 나타내는 Cryptosporangium aurantiacum(CaPETase)의 PET 가수분해효소를 보고합니다. 우리는 다른 PET 가수분해효소와 비교하여 활성 부위와 기질 결합 틈을 형성하는 잔기에서 뚜렷한 백본 구조를 표시하는 CaPETase의 결정 구조를 밝힙니다. 우리는 CaPETaseWT와 비교하여 Tm이 83.2°C이고 60°C에서 41.7배 향상된 PET 가수분해 활성으로 강력한 내열성을 나타내는 CaPETaseM9 변종을 추가로 개발합니다. CaPETaseM9는 pH-stat 생물반응기에서 55°C에서 반나절 이내에 투명하고 착색된 사용 후 PET 분말을 거의 완전히 분해합니다.

플라스틱은 합성고분자로서 내화학성, 경량, 저비용 등의 장점을 가지고 있습니다. 이는 1950년대부터 전 세계적으로 광범위하게 사용되었으며 우리 일상 생활에 필수적인 요소가 되었습니다1,2. 그러나 플라스틱은 자연적으로 분해되지 않기 때문에 매립지에 있는 수십억 톤의 플라스틱 폐기물이 바다의 황무지 섬에 떠다니고 미세 플라스틱으로 분산되어 심각한 글로벌 오염을 초래했습니다3,4,5,6,7. 전 세계 정부와 플라스틱 제조업체는 이러한 문제를 인식하고 있으며, 최근 몇 년간 플라스틱 폐기물의 화학적, 생물학적 재활용 전략에 초점을 맞춘 연구 개발이 가속화되었습니다8,9,10.

테레프탈산(TPA)과 에틸렌 글리콜 단위로 구성된 폴리에스테르인 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET)는 널리 사용되는 플라스틱 포장재이며 상대적으로 재활용이 쉽습니다. PET의 생물학적 분해에 관한 연구는 지난 20년 동안 활발하게 진행되었습니다8,11,12,13. PET 바이오 재활용 기술에는 PET를 미생물이나 효소에 의해 가수분해하여 고부가가치 화학물질로 전환시키는 기술이 포함되며, 이는 궁극적으로 PET의 순환경제를 구축한다11,14,15,16.

현재까지 PET를 가수분해할 수 있는 다양한 효소가 생화학적, 구조적으로 발견되고 특성화되었습니다. 특히, Ideonella sakaiensis 201-F6(IsPETase)의 PETase는 주변 온도에서 가장 높은 PET 가수분해 활성을 나타내며 PET 폐기물 처리에 유망한 효소로 간주됩니다. 이에 현재 IsPETase의 PET 가수분해 효율과 열안정성을 향상시키기 위한 다양한 효소공학 연구가 진행되고 있으며, 성능이 향상된 변이체가 보고되고 있다18,19,20,21,22,23,24. 최근에는 호열성 특성을 나타내는 메타게놈 유래 잎가지 퇴비 큐티나제(LCC)가 발견되었습니다25. 이 변종은 72°C의 생물반응기 시스템에서 높은 PET 해중합 활성을 나타내어 생물학적 PET 재활용 후보가 되는 것으로 나타났습니다. 또한, 새로운 PET 분해효소를 발굴하려는 노력이 이루어지고 있으며, Thermobifida fusca cutinases (TfCut1,2)27, Thermomonospora curvata DSM43183 cutinases (Tcur1278,0390)28, Bacterium HR29 (BhrPETase) 등 다양한 미생물 및 환경 메타게놈의 효소들이 )29, Fusarium solani pisi (FsCut)30, Humicola insolens (HiC)31,32, PET233, PET533, PET633 및 PHL734가 보고되었습니다. 그리고 최근에는 생물정보학의 게놈 마이닝을 통해 내열성 PET 가수분해효소가 발견되었습니다.

효소적 PET 가수분해의 실현 가능한 적용을 위해서는 PET 가수분해효소의 본질적으로 높은 촉매 활성이 출발점으로서 중요한 요소입니다. 또한, 호열성 PET 가수분해효소 특성을 활용하는 것도 우수한 PET 가수분해효소 개발을 위한 효율적인 전략입니다. 왜냐하면 PET 재료의 유리 전이 온도 근처의 고온 작업이 PET 분해 성능에 유리하기 때문입니다. 따라서 촉매 반응에 대한 통찰력을 제공하고 효율적인 PET 생체촉매의 범위를 확장하려면 높은 촉매 활성과 높은 열안정성을 모두 갖는 유망한 PET 분해 효소의 발견이 강력히 필요합니다.

40%) using I. sakaiensis PETase (Accession code: GAP38373.1) to query the model. Partial genes were removed from the retrieved sequences, and then sequences of the PETase candidates were randomly selected from the dataset. Multiple sequence alignment was performed using Clustal omega49. Phylogenetic reconstruction was performed via maximum likelihood (ML) using MEGA11 with the Dayhoff w/freq. model50,51. The tree with the highest log likelihood (−10401.10) is shown. Initial trees for heuristic search were obtained automatically by applying Neighbor-Join and BioNJ algorithms to a matrix of pairwise distances estimated using the JTT model, and then the topology with a superior log likelihood value was selected. Discrete gamma distribution was used to model evolutionary rate differences among sites (5 categories [+G, parameter = 1.6961]). The rate variation model allowed for some sites to be evolutionarily invariable ([+I], 4.28% sites). This analysis involved 27 amino acid sequences, and there was a total of 444 positions in the final dataset. Bootstrap values were obtained from 1000 replicates52. Sequence alignment of enzymes used in phylogenetic tree analysis was depicted as a graphical illustration using ESPript3 (Supplementary Fig. 1)53. Pairwise identity and similarity of the proteins were calculated using the Clustal omega method, and a sequence identity matrix was created using excel software./p>